1. Recuperação
●1. Retire o criotubo do nitrogênio líquido, coloque-o imediatamente em banho-maria a 37 graus e agite-o levemente. Depois que o líquido derreter (cerca de 1-1,5 minutos), retire-o e borrife um pouco de álcool e coloque-o na bancada ultralimpa.
●2. Aspire a suspensão de células acima em um tubo de centrífuga de 15ml preenchido com 10ml de meio (lave o tubo de criopreservação com meio para lavar todas as células aderidas à parede) e centrifugue a 1000 rpm por 5 minutos.
●3. Despeje o sobrenadante e adicione 1ml de meio para suspender as células. Aspirado em uma placa de Petri de 10 cm contendo 10 mL de meio de cultura e agitado suavemente para frente e para trás para distribuir uniformemente as células na placa de Petri.
●4. Rotule o tipo de célula e a data, o nome do cultivador, etc., e coloque-o em uma incubadora de CO2 para cultivo. Após as células aderirem à parede, troque o meio.
●5. Troque o meio a cada 3 dias.
2. Passagem
●1. Passagem quando a cobertura celular na placa de cultura atinge 80 por cento -90 por cento.
●2. Aspirar o meio original.
●3. Adicione tripsina apropriada (apenas o suficiente para cobrir as células) e faça a digestão por 1-2 minutos.
●4. Depois que as células estiverem arredondadas, adicione um volume igual de meio contendo soro para terminar a digestão.
●5. Use uma pipeta para suspender as células por pipetagem.
●6. Aspirar as células em um tubo de centrífuga de 15ml e centrifugar a 1000 rpm por 5 minutos.
●7. Despeje o sobrenadante, adicione 1-2ml de meio e exploda as células.
●8. Transfira as células para vários pratos, dependendo do tipo de célula. Geralmente, existem 5 células cancerígenas e 3 células normais. Continue a cultivar.
3. Criopreservação Digerir as células e centrifugar (ibid.). Suspenda as células com a solução de congelamento preparada e distribua-as em criotubos esterilizados, deixe-os repousar por alguns minutos e indique o tipo de célula e a data de criopreservação. 4 graus por 30 minutos, -20 graus por 30 minutos, -80 graus durante a noite e, em seguida, colocados em nitrogênio líquido para armazenamento. Preparação da solução de criopreservação: 70 por cento de meio completo mais 20 por cento de FBS mais 10 por cento de DMSO. O DMSO deve ser adicionado lentamente, gota a gota, agitando enquanto goteja.
