Hoje, vamos falar sobre um elemento-chave em experimentos de PCR - consumíveis. Como visitante frequente da PCR, é necessário entender as características e a terminologia relacionada aos consumíveis de PCR.
Existe uma grande variedade de consumíveis PCR no mercado, incluindo marcas, especificações, cores, etc., que são deslumbrantes. Vamos entender passo a passo.
placa pcr
1. Materiais
Normalmente, a matéria-prima dos consumíveis de PCR é o polipropileno. É um bom material inerte resistente ao calor. A faixa de temperatura de trabalho é -30 a 140 graus, o que permite suportar as mudanças de energia térmica durante o ciclo térmico da reação de PCR e desempenha um bom papel na vedação e proteção das substâncias no sistema de reação de PCR.
Saiba mais sobre o polipropileno
2. Cor
Os mais comuns são tubos brancos e tubos de PCR transparentes. Em experimentos de PCR tradicionais, não há diferença entre os dois. No entanto, no mesmo experimento em tempo real/qPCR, os tubos brancos foram relativamente mais sensíveis e consistentes para instrumentos qPCR com leituras de sinal apical (consulte as Figuras A e B abaixo). Por que é assim?
tubo pcr
A: valores de Ct mais baixos para tubos brancos em comparação com tubos transparentes; B: melhor repetibilidade com tubos brancos.
Os dados principais do qPCR são o valor Ct e o sinal de fluorescência é a fonte de dados para calcular o valor Ct, por isso é muito importante saber se a fluorescência no tubo pode ser completamente transmitida ao detector. A parede branca do tubo impede que a fluorescência passe pela parede do tubo e refrate (Figura A abaixo), evitando assim que a fluorescência seja transmitida para o bloco de aquecimento (ou seja, a parede do orifício de metal onde o tubo é colocado) e seja absorvida ou inconsistentemente refletido pelo bloco. Um sinal fluorescente mais forte e concentrado foi coletado na ponta do tubo branco em comparação com o tubo transparente (Figura B abaixo).
tubo pcr
A: A tendência de mudança do sinal de fluorescência no tubo transparente e no tubo branco; B: A comparação da intensidade de fluorescência após a adição da mesma quantidade de fluoresceína.
Portanto, se você estiver usando um instrumento qPCR de alta leitura, experimente os tubos brancos.
3. Qualidade (Lean ou Not Lean)
A importância da qualidade dos consumíveis é enfatizada aqui. Os consumíveis qPCR devem estar livres de contaminantes e inibidores. Alta pressão e radiação removem bactérias e DNases, mas não poeira e resíduos de DNA, que podem inibir reações de PCR ou produzir amplificação inespecífica. Substâncias têm absorbância, e mesmo pequenos poluentes irão absorver a fluorescência no sistema de reação e afetar a coleta de sinais de fluorescência. Uma versão exagerada do experimento foi usada para demonstrar o efeito da contaminação por impurezas no experimento. Conforme mostrado na figura abaixo, uma impureza foi colocada em um dos poços de reação da oitava. Como esperado, as curvas de amplificação mostraram anomalias marcantes.
Impurezas em tubos de reação de PCR
↑ Impurezas no tubo de reação
8 tiras
↑ Resultados de reações repetidas para 8 tubos, a impureza do poço esquerdo "desvia" a curva.
Lembrete: Tenha cuidado para não expor os consumíveis ao ar por muito tempo. Depois de retirar os consumíveis, certifique-se de fechar a embalagem rapidamente para evitar tocá-la com as mãos desprotegidas. Se possível, trabalhe em uma bancada limpa.
4. Capacidade / Tamanho / Fluxo
O volume determina quanta amostra (volume de reação) pode ser carregada. A superdosagem pode resultar em redução da eficiência da transferência de calor, derramamento ou contaminação cruzada; subdosagem pode resultar em perda de amostra por evaporação. O bloco de aquecimento do instrumento qPCR também determinará os consumíveis aplicáveis e o tamanho do sistema de reação aplicável. A taxa de transferência é fácil de entender, é o número máximo de amostras que podem ser carregadas em um único experimento. As especificações comuns de capacidade e fluxo são mostradas na tabela abaixo:
Tubo único/oito fileiras {{0}}.2mL, 0,1mL
{{0}}placa de poços 0.2mL, 0,1mL
{{0}}placa de poços 0,2mL
As especificações de capacidade também são geralmente divididas em tipos padrão e baixo, conforme mostrado abaixo. Os consumíveis de baixo perfil têm uma altura menor. Este design curto minimiza o espaço acima do sistema de reação ("volume morto" - a parte inútil), reduz os efeitos da evaporação durante o ciclo térmico e permite que o módulo de aquecimento o envolva em maior extensão para melhorar a eficiência da transferência de calor. Portanto, os tubos de baixo perfil também são conhecidos como tubos ou placas "rápidas".
tubo pcr
Lembrete: O volume de reação comumente usado é de 20 µL, e é recomendado usar um tubo de reação de pequeno volume de 0,1 mL ou um pequeno volume.
5. Espessura da parede
A espessura da parede do tubo afeta diretamente a condutividade térmica. Os consumíveis de PCR devem ter espessura de parede uniforme para fornecer transferência de calor consistente. A parede ultrafina do tubo é 50% mais fina que a versão padrão, o que reduz ainda mais a barreira térmica e traz efeitos de resposta mais rápidos e melhores. Portanto, para maximizar a eficiência das reações de PCR e garantir reações estáveis e eficientes, consumíveis de PCR uniformes e ultrafinos são a melhor escolha.
6. Transparência
As tampas e os filmes de vedação para qPCR exigem alta clareza óptica para garantir penetração e transmissão ideais de sinais fluorescentes, reduzindo a distorção (para instrumentos qPCR de leitura superior). Quanto maior a transparência da parede do tubo, pode afetar os resultados experimentais. A razão foi explicada acima. O PCR tradicional pode ignorar esse recurso.
7. Saias
A borda de uma placa de PCR refere-se à extensão periférica da placa. Ao construir sistemas de reação, a saia atua como um suporte estável para processos de pipetagem e fornece resistência mecânica e aderência quando combinada com estações de trabalho automatizadas. Existem três tipos comuns de saias, meias-saias e saias cheias (correspondentes a A, B e C na figura abaixo).
Sem saia: Pode ser usado com a maioria dos instrumentos de PCR ou qPCR, mas não para aplicações automatizadas. Fácil de mover durante a pipetagem, não muito estável, precisa ser usado com um suporte de placa.
Meias saias: Ideal para aplicações automatizadas com boa estabilidade de pipetagem.
Placa de saia completa: Ideal para aplicações automatizadas. Boa resistência mecânica, adequado para instrumentos de PCR com módulos salientes, alta estabilidade durante a pipetagem.
placa pcr
Dicas: O significado da saia é mais para facilitar a industrialização e o processamento automatizado de lotes, combinado com o braço robótico. Pode não ser necessário em laboratórios de pesquisa tradicionais, nenhuma saia é suficiente.
placa pcr
8. Parafilme
O filme de vedação da placa de PCR é feito de plástico transparente ou folha de alumínio. Filmes transparentes adesivos são mais comuns, adequados para placas de 96 ou 384 poços e devem ter transmitância de luz suficientemente boa. Ao selar o filme, um pequeno cartão será usado para pressionar o filme ao redor do orifício de vedação para evitar vazamento de ar.
Filmes adesivos de alumínio podem ser menos comuns. Embora não seja adequado para qPCR, é o consumível ideal para amostras sensíveis à luz. Por poder ser perfurado, facilita a transferência de amostras em PCR (para PCR convencional).
Filme de vedação de placa de PCR
Resumir
Como o portador do sistema de PCR, os consumíveis são muito importantes para melhorar a qualidade dos dados experimentais. Espero que este compartilhamento possa ajudá-lo a entender algumas dicas sobre consumíveis de PCR e fornecer ajuda para uma melhor seleção de consumíveis.
