Como todos sabemos, os tipos de células cultivadas em laboratório podem ser divididos em dois tipos: células aderentes e células em suspensão, e apenas alguns tipos de células existem em ambos os estados.
Células de suspensão referem-se a um tipo de células que podem crescer em um estado suspenso em um meio sem depender de suportes, como linfócitos e a maioria das células derivadas do sistema sanguíneo. (como células de leucemia de camundongo WEHI-3, células de leucemia humana K-562, HL-60). Na indústria, cada vez mais células aderentes foram domesticadas e cultivadas em suspensão total. Atualmente, as células SP2/0, NS0, CHO, BHK e HEK293 são usadas principalmente na indústria e são usadas principalmente para a produção de proteínas recombinantes; as células de passagem comumente usadas em produtos biológicos veterinários incluem principalmente células BHK21 cultivadas em suspensão total, células MDCK; e células Vero, células PK, células ST, células Marc145, etc. com a ajuda da cultura em suspensão de microtransportadores, cada célula tem características diferentes.
Células de suspensão
Células de suspensão "thp-1" 200x
Em geral, as células em suspensão são mais fáceis de manusear do que as células aderentes porque nenhuma tripsinização é necessária para a passagem das células em suspensão. Mas isso não significa que as células em suspensão sejam mais fáceis de crescer do que as células aderentes. Para iniciantes, é mais desafiador. Sempre há vários problemas: por exemplo, por que sempre aparecem células mortas e diferenciação celular; concorda-se que a passagem é fácil, mas o resultado será a diferenciação; os problemas aparecem novamente após a criopreservação e recuperação!
A seguir, vamos discutir alguns pontos-chave sobre o cultivo de células em suspensão~
Ponto 1: Bastante paciência, é muito necessário
Muitas células em suspensão têm uma viabilidade relativamente baixa quando são recuperadas da criopreservação. Neste momento, precisamos ser pacientes o suficiente para esperar que as células concluam sua autorreparação e entrem na fase de crescimento logarítmico. Por exemplo, THP-1 (leucemia monocítica humana) geralmente precisa de 7-10 dias de período de recuperação desde o descongelamento até a proliferação normal; Jurkat, Clone E6-1 (células de leucemia linfocítica T humana) também precisa de 5-7 dias após a recuperação. Retorne ao estado antes de congelar. Os novatos podem desistir de treinar durante este período, então seja mais paciente! Cultivar essas células também é um processo de cultivar a paciência!
Ponto 2: Segure a densidade de inoculação
De um modo geral, a densidade das células de suspensão não deve ser inferior a 500,000/ML. Muitas células em suspensão são dependentes da densidade e a não proliferação causada pela baixa densidade também é um dos problemas comuns para iniciantes. Claro, existem muito poucas células cujo estado piora quando a densidade é alta, como W6/32 (células de hibridoma de células B de camundongo). Portanto, é muito importante buscar informações relevantes para entender as características das células antes de cultivar células desconhecidas. Somente conhecendo a si mesmo e ao inimigo você pode vencer todas as batalhas!
A frequência de substituição do meio não deve ser limitada a "claramente". As células são seres vivos. Durante um ciclo de cultura contínuo, nutrientes específicos, como meio suplementar e glicose, podem ser adicionados várias vezes, dependendo do estado de crescimento das células para manter um bom estado de crescimento das células. . Durante o processo de cultura em suspensão, com a proliferação de células, o consumo de nutrientes no meio original e o aumento de metabólitos, a viabilidade das células diminuirá e a suplementação oportuna de nutrientes tornará as células em um ambiente de vida relativamente bom. Não vou entrar em detalhes aqui e evitar centrifugações frequentes e reposição de líquidos.
Vamos falar sobre o método de reposição de líquidos:
①Método de troca centrífuga de líquido completo
Ou seja, remova todo o meio antigo por centrifugação (800-1000rpm, 5min) e substitua por meio novo. Este método é adequado para a substituição do meio de células em suspensão bem levantadas "pele sólida" (como K562), ou a situação atual em que as células estão em boas condições e a densidade é alta, resultando em um grande consumo de meio. A vantagem deste método é que o meio é trocado completamente e alguns detritos celulares podem ser removidos, mas também causará um certo grau de dano mecânico às células.
②Método de meia troca centrífuga
Ou seja, centrifugando (800-1000rpm, 5min) 50 por cento de suspensão de células, substitua 50 por cento do volume de meio fresco. Este método é adequado para comparar células "hipócritas" difíceis de cultivar (como thp-1) ou a situação em que a densidade é baixa, mas mais detritos precisam ser removidos no estado de ajuste.
③Método de troca de líquido de sedimentação
Ou seja, em vez de usar uma centrífuga, o método de sedimentação natural por gravidade é usado para separar o meio das células, de modo a substituir todo ou parte do meio fresco. No entanto, tem limitações de aplicação - é adequado apenas para células que podem formar aglomerados de células de um determinado tamanho (caso contrário, não podem se estabelecer naturalmente e só podem ser centrifugadas em baixa velocidade), especialmente ao lidar com células que dependem da agregação celular para proliferar , como NK-92, NK- 92 MI, Jurkat. Este método pode minimizar o dano mecânico causado pelo processo de centrifugação durante o processo de troca de líquido, enquanto retém a massa celular agregada e a remoção de detritos celulares é relativamente completa.
Depois de dominar os pontos acima, além de uma boa semente de células, está ao virar da esquina para cultivar "lindas" células de suspensão!
placa de cultura celular
A placa de cultura de células em forma de U da Yongyue Medical é usada principalmente para cultivar células em suspensão, usando poliestireno (PS) de grau médico, produzido em uma oficina de purificação de nível 100000-, esterilizada por irradiação, livre de DNase, RNase e pirogênio -livre, Segurança e proteção ambiental.
As placas de cultura celular estão disponíveis em várias especificações para atender às necessidades de várias culturas bacterianas. Os tipos de produtos são divididos em 6-bem, 12-bem, 24-bem, 48-bem, 96-bem e 384-bem, de qual 96-poço é dividido em fundo plano, fundo em U, fundo em V; As placas de cultura em forma de U são usadas principalmente para cultivar células em suspensão; Placas de cultura em forma de V são usadas principalmente para experimentos de hemaglutinação imunológica.
