1. Na placa de cultura, mergulhe as lâminas que foram escaladas com PBS três vezes por 3 minutos de cada vez.
2. Fixe as lâminas com paraformaldeído a 4% por 15 minutos e mergulhe as lâminas em PBS por 3 vezes, 3 minutos de cada vez.
3. Permeabilize com 0.5 percent Triton X-100 (preparado em PBS) por 20 minutos em temperatura ambiente (para antígenos expressos na membrana celular, esta etapa é omitida).
4. Bloqueio de soro: mergulhe as lâminas em PBS por 3 vezes por 3 min de cada vez, seque o PBS com papel absorvente, adicione soro de cabra normal (desde que a fonte secundária de anticorpo seja de cabra) nas lâminas e bloqueie em temperatura ambiente por 30 minutos.
5. Adicione o anticorpo primário: Absorva a solução de bloqueio com papel absorvente, não lave, adicione uma quantidade suficiente de anticorpo primário diluído a cada lâmina e coloque-a em uma caixa úmida, incube a 4 graus durante a noite.
6. Adicione o anticorpo secundário fluorescente: mergulhe as lâminas em PBST por 3 vezes, 3 minutos de cada vez, absorva o excesso de líquido nas lâminas com papel absorvente, adicione o anticorpo secundário fluorescente diluído gota a gota, incube a 20-37 graus por 1h em uma caixa molhada, mergulhe em PBST Slice 3 vezes, 3 min de cada vez.
Nota: A partir da adição de anticorpo secundário fluorescente, todas as etapas subsequentes devem ser realizadas em local escuro o máximo possível.
7. Bloqueio de soro: seque o líquido com papel absorvente, coloque soro de cabra normal na lâmina de vidro (desde que a fonte secundária de anticorpos seja de cabra) e bloqueie à temperatura ambiente por 30 minutos.
8. Adicione o anticorpo primário: Absorva a solução de bloqueio com papel absorvente, não lave, depois adicione o anticorpo primário diluído gota a gota e incube durante a noite em uma caixa úmida de 4 graus no escuro após adicionar o anticorpo primário. (Nota: a espécie do segundo anticorpo primário é diferente da espécie do primeiro anticorpo primário, como camundongo e coelho)
9. Adicione o anticorpo secundário fluorescente: mergulhe as lâminas em PBST por 3 vezes, 3 minutos de cada vez, absorva o excesso de líquido nas lâminas com papel absorvente, adicione o anticorpo secundário fluorescente diluído gota a gota, incube a 20-37 graus por 1h em uma caixa molhada, mergulhe em PBST Slice 3 vezes, 3 min de cada vez. (Nota: Se a fluorescência vermelha for selecionada para a detecção do primeiro anticorpo, o segundo deve selecionar outras cores de fluorescência)
10. Núcleos de contracoloração: DAPI foi adicionado gota a gota e incubado no escuro por 5 minutos, as amostras foram coradas e o excesso de DAPI foi lavado com PBST 5min×4 vezes.
11. Seque o líquido na lâmina com papel absorvente, sele a lâmina com um líquido de montagem contendo extintor antifluorescência e observe e colete imagens sob um microscópio de fluorescência.
