1. Recuperação celular
Depois que as células criopreservadas foram removidas do nitrogênio líquido, elas foram descongeladas com agitação constante em banho-maria a 37 graus. Transfira as células descongeladas para um tubo de centrífuga, adicione meio DMEM completo pré-aquecido a 37 graus (do qual o soro bovino fetal é cerca de 10 por cento), sopre suavemente uniformemente, centrifugue a 500 g por 2 min e descarte o sobrenadante.
Adicionar meio DMEM completo para lavar e descartar o sobrenadante. Adicione o meio DMEM completo, misture delicadamente por pipetagem, faça uma suspensão de células, inocule em uma placa/frasco de Petri e cultive em uma incubadora de células contendo 5 por cento de CO2.
2. Passagem celular
Quando a densidade celular atinge 80 por cento ~ 90 por cento (rendimento prematuro é insuficiente, células muito tardias estão em más condições, subcultura em uma proporção de 1:2 a 1:10 ou mais, geralmente 1:3 a 1:5 geração de células, isto é, da inoculação celular No momento da separação e novo cultivo, o meio completo foi removido e lavado duas vezes com 1X PBS.
Adicione tripsina (nota: a quantidade de solução de digestão é melhor para cobrir as células e a temperatura ideal de digestão é de 37 graus. Observe as células ao microscópio: observe as células digeridas ao microscópio invertido, se o citoplasma estiver retraído, as células não estão mais conectadas. Fatias, indicando que as células foram digeridas adequadamente neste momento), digerir e colocá-las em uma incubadora de células por cerca de 2-3 minutos.
Adicione uma quantidade apropriada de meio DMEM completo para interromper a tripsinização, transfira para um tubo de centrífuga e centrifugue a 500 g por 2 min, descarte o sobrenadante, adicione meio DMEM completo para lavar e descarte o sobrenadante.
Adicione o meio DMEM completo, misture pipetando suavemente, pipete 10 microlitros para contagem e continue a cultura em uma incubadora de células contendo 5 por cento de CO2 de acordo com o volume celular necessário.
3. Criopreservação celular
Quando a densidade celular atingir 80 por cento ~ 90 por cento, remova o meio completo e lave 2 vezes com 1X PBS. Adicione tripsina para digestão e coloque em uma incubadora de células por cerca de 2-3 min. Adicionar meio DMEM completo para parar a digestão de tripsina, transferir para um tubo de centrífuga e centrifugar a 500 g por 2 min, descartar o sobrenadante, adicionar meio DMEM completo para lavar e descartar o sobrenadante. Adicione 1 ml de solução de congelamento (90 por cento de soro bovino fetal, 10 por cento de DMSO. De um modo geral, o conteúdo do soro pode ser ajustado entre 10 por cento e 90 por cento. Adicionar soro à solução de congelamento pode fornecer nutrientes para as células, por um lado, e pode Fornecer substâncias protetoras não permeáveis durante a criopreservação celular, como sacarose, albumina, etc. Congele em uma geladeira de 4 graus por 30 minutos, depois coloque-a em uma geladeira de -20 graus por 30 minutos e, em seguida, coloque-a em uma geladeira de -80 graus durante a noite.
Coloque no nitrogênio líquido no dia seguinte, pode ser armazenado por pelo menos dois anos, e se não colocar no nitrogênio líquido, pode ser armazenado por três meses.
O princípio da criopreservação e recuperação de células é: congelamento e descongelamento lentos, o que é mais propício para manter a viabilidade celular. A criopreservação de células sem qualquer agente protetor levará à produção de cristais de gelo intracelulares, que causarão danos mecânicos endógenos às células, causarão alterações na pressão osmótica do ambiente intracelular, pH, eletrólitos, etc., e então promoverão a morte celular.
4. Assuntos que precisam de atenção
(1) Pré-aquecimento da solução de cultura: coloque o frasco preparado contendo a solução de cultura, PBS e tripsina em banho-maria a 37 graus para pré-aquecer;
(2) Use álcool 75 por cento para limpar a bancada de trabalho ultralimpa e as mãos que foram irradiadas com raios ultravioleta;
(3) Colocação correta dos instrumentos usados: garanta espaço operacional suficiente, que não seja apenas fácil de operar, mas também reduza a poluição;
(4) Acenda o lampião a álcool: observe que a chama não deve ser muito pequena;
(5) operação asséptica rigorosa;
(6) Digestão moderada de células aderentes: O tempo de digestão é afetado por muitos fatores, como o tipo de solução de digestão, o tempo de preparo e a quantidade adicionada ao frasco de cultura. Durante o processo de digestão, deve-se prestar atenção às mudanças na forma das células cultivadas. Assim que o citoplasma encolher, se a conexão se soltar ou houver sinais de flutuação em pedaços, a digestão deve ser interrompida imediatamente;
(7) Todas as operações em células de passagem devem ser o mais próximo possível da chama de uma lamparina a álcool. É melhor trabalhar com apenas uma célula por vez, usando um conjunto de equipamentos para cada célula. evitar infecção cruzada;
(8) A boca da garrafa da célula passada precisa ser esterilizada em uma lâmpada de álcool toda vez que for aberta ou fechada.
